一、培养基制备规程

　　1.目的

　　规范本中心微生物实验室培养基制备工作，保证培养基的质量。

　　2.适用范围

　　本规程适用于使用商品化干粉培养基制备各种待用培养基。

　　3.职责

　　3.1 培养基制备人员负责按本规程制备各类培养基，及时填写成品培养基制备记录，编制培养基目录，粘贴标签。

　　3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员按规程制备培养基。

　　4.制备程序

　　4.1 概述

　　4.1.1 制备培养基所用的化学药品，均为化学纯。有些试剂在使用前应先试用。

　　4.1.2 使用脱水培养基和其他含有有害物质（如胆盐或其他选择剂）的成分时，应遵循良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。

　　4.1.3 使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制。如质量/体积、PH、制备条件、灭菌条件和操作步骤等。

　　4.1.4 使用各别成分制备培养基时，应按配方准确配制，并记录所使用成分的特性。

　　4.1.5 制备培养基常用的容器为玻璃、不锈钢铝、锅或搪瓷容器。不宜使用铜或铁锅。培养基中的含铜量过高时（＞0.3mg/1000ml），细菌不易生长；含铁量过高时（＞0.14mg/1000ml），则妨碍细菌毒素的产生。

　　4.2 水

　　4.2.1 制备培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，以排除测试条件下抑制或影响微生物生长的物质。电阻率在25℃时应300000cm。最好每周检测一次。

　　4.2.2 制备培养基时避免采用离子交换器生产的去离子水，其微生物含量可能较高，这种水在过滤灭菌后仍可能带有细菌生长的抑制因子。

　　4.3 称量和复水

　　4.3.1 称量所需量的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。

　　4.3.2 必须选择合适的天平和量筒，以确保称量和移液的准确性。

　　4.4 溶解和分装

　　脱水培养基加水后应适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟。用各别成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。

　　4.5 测定和调整PH

　　4.5.1 用PH计或精密PH纸测pH，必要时进行调整。

　　4.5.2 在实验室用各别成分制备的培养基，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，PH的变化不应超过0.2个单位。

　　4.5.3 一般使用浓度约为40g/L(约1mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L(约1mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。

　　4.6 分装

　　将配制好的培养基根据使用要求分装到适当的容器中，并及时密封好。

　　4.7 灭菌

　　4.7.1分装好的培养基应当天进行灭菌处理（2小时内灭菌最佳）。

　　4.7.2实验室采用湿热灭菌对培养基进行灭菌处理，按照培养基使用说明采用合适的灭菌温度和时间。

　　4.8 保存

　　制就的培养基不宜保存过长，以少量勤做为宜。培养基存放于暗处和（或）4℃～12℃冰箱的密封袋或平皿筒中可延长贮存期限。

　　4.9 制备记录

　　培养基制备完毕后，应及时填写成品培养基制备记录和成品培养基目录清单，并在外包装上贴好相应的标签，标明名称，编号，制备日期和有效期等内容。

　　二、培养基使用规程

　　1. 目的

　　规范本中心微生物实验室培养基的使用和管理。

　　2. 适用范围

　　本规程适用于培养基的储存、融化和废弃等。

　　3. 职责

　　3.1 检验人员：按照本规程规范使用培养基、定期检查培养基是否失效。

　　3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员规范使用培养基。

　　4.使用程序

　　4.1 培养基的储存

　　4.1.1 除特殊说明和标准规定，通常情况下基础培养基（如营养琼脂培养基）应在4℃冰箱中保存不超过3个月，或在室温（20℃）下保存不超过一个月。

　　4.1.2 灭菌后的培养基应置适当条件下保存至规定的有效期，并对保存条件进行确证,详见表1。

　　 表1 培养基2～8℃条件保存期限

　　培养基种类

　　保存条件

　　保存时间

　　平板培养基

　　不密封

　　2周

　　密封

　　6～8周

　　试管培养基

　　（棉塞）

　　不密封

　　2～4周

　　密封

　　8～10周

　　试管培养基

　　（软木塞或腊封）

　　不密封

　　8周

　　密封

　　16～18周

　　4.2 琼脂培养基的融化

　　4.2.1 将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽，如100℃）使之融化。经过高压的培养基应尽量减少重加热时间，避免过度加热。

　　4.2.2 培养基融化后放入47℃2℃的恒温水浴锅或恒温培养箱中保温，直至使用。

　　4.2.3 融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h，不可二次融化。

　　4.3 培养基的脱气

　　必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度。

　　4.4 添加成分的加入

　　对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃2℃时再加入。灭菌的添加成分在加入之前，应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。将加入添加成分的培养基缓慢充分混匀，尽快分装到待用的容器中。

　　4.5 平板的制备和储存

　　4.5.1 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（直径90mm的平皿通常要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。

　　4.5.2 为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。

　　4.5.3 凝固后的培养基应立即使用或放于暗处和（或）4℃～12℃冰箱中，储存期限见4.1培养基的储存。 并在外包装上贴好相应的标签，标明名称，编号，制备日期和有效期等内容。

　　4.5.4 对于采用表面接种形式培养的固体培养基。应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱/培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

　　4.6 培养

　　4.6.1 培养时每垛最多堆放六个平板，平板间要留有空隙以保证空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致。

　　4.6.2 在培养过程中，培养基会损失水分。当水分损失的量大于培养基总量的15%时，就会影响微生物的生长。造成培养基水分损失的因素较多，如培养基成分，平皿中培养基总量和培养箱的类型等（如使用带风扇的培养箱，培养箱中的湿度偏低，平板在培养箱中位置靠近培养箱内壁等），操作时应注意避免。

　　4.7 培养基的弃置

　　培养基废弃前，实验室采用121℃、15分钟蒸汽灭菌，或煮沸消毒30分钟。